2018-11-05
正文
最近，派森諾生物與南京大學合作，在《Bioresource Technology》（影響因子：5.807）發表論文，研究了5°C下添加氯化銨、尿素、L-丙氨酸和D-丙氨酸的SBRs性能，蛋白質、腐殖質、核酸、尿素和游離氨基酸等多種反應器出水特異性DON組成和細胞膜特征、相關基因和微生物群落結構，加深了我們對廢水處理中DON起源和潛在威脅的認識。
研究背景
低溫（<15°C）可能導致活性污泥（AS）的氨化、硝化和反硝化作用活性下降，這將導致出水DON增加，NH4+和NO2-富集，NO3-積累和一氧化二氮（N2O）流出等問題。許多工作都集中在硝化和反硝化作用，以獲得可靠的替代品和在低溫下成功運行。作為富營養化源和潛在形成的氮源消毒副產物（N-DBPs），出水DON問題已成為低溫下污水處理廠（WWTP）關注的問題。氮源類型對AS群落結構，微生物組成和代謝產物有很大影響，導致出水可溶性微生物產物（SMPs）、游離氨基酸、NO3-濃度的變化。有趣的是，大多數的研究都是關于氯化銨或者室溫下的真實廢水的，只有少數研究關注到了添加成分。此外，目前尚缺少對于形成DON的氮源的研究。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq、Illumina Hiseq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA基因V1-V2區測序、宏基因組測序
生物反應器設計：5°C（培養箱：Sanyo Electric）下運行的添加氯化銨、尿素、L-丙氨酸和D-丙氨酸進料的四個SBRs（R1，R2，R3和R4），工作體積為2L。播種污泥（SS）取自中國南京市污水處理廠的曝氣池（懸浮固體濃度約4400 mg / L）。根據參考文獻選擇5°C，由于緯度受限和季節變化（40-50°N），冬季的WWTPs存在大約30天的脫氮問題。SS之前沒有在低溫下馴化過。SBR的水力停留時間為12 h，進料時間、反應時間、沉降時間和空轉時間分別為0.5 h，10 h，0.5 h和1 h。從反應器的中間孔排放出水，容積交換率為50%。反應器一般使用濃度為4000 mg/L（揮發性懸浮固體：2433-2979 mg/L）和氧濃度為7.6-8.0 mg/L的固定混合液體懸浮液（MLSS）運行。每周一次從反應器中抽出剩余的污泥。
圖1：反應器設計
研究結果
1、生物反應器的性能
R2和R4的COD去除率較高（85.39%和86.82%），R3的COD去除率（81.56%）在穩定過程中低于其他反應器（COD去除率> 80%）。R1，R2，R3和R4的出水TN濃度在穩定期顯示為13.49±0.43 mg / L，15.91±0.42 mg / L，14.79±0.53 mg / L和15.81±0.68 mg / L。值得注意的是，用尿素馴化的反應器在5°C時表現出更高的出水NH4 + -N濃度（8.59±1.36 mg / L）。相比之下，用氯化銨進行SBR進料的NH4+ -N去除率為89.15%-94.74%。該研究在沒有特殊缺氧時間的情況下，反硝化效率有限，出水NO3--N仍然是氮的主要存在形式（R1-8.63±0.52 mg / L；R3-6.59±0.65 mg / L和R4-8.31± 1.02 mg / L），除了添加尿素的R2（2.34±0.81 mg / L）外。不同氮源的出水DON與TN去除率沒有依賴關系（尿素>氨氯> L-丙氨酸> D-丙氨酸）。
圖2：35天內不同氮源的SBR在5°C時COD去除率（A），出水DON（B），TN（C），NH4+ -N（D），NO3- - N（E）和NO2- - N（F）
2、具體的DON組成
蛋白質類似物和腐殖質類似物是AS系統在低溫下的主要成分。R4（D-丙氨酸）的流出蛋白質類似物組分的熒光強度（FI）顯著高于其他反應器。此外，R1（氯化銨）的流出腐殖質類似物成分的熒光強度與其他成分相比更高。然而，R2的流出蛋白質類似物和腐殖質類似物成分顯示出相對較低的大分子物質，盡管它們具有最高的DON。不同的氮源導致5°C時出水DON組分的多樣性。R1、R3、R4的出水蛋白濃度（R1-35：4.85 mg/L， R3-35：4.55 mg/L，R4-35：4.44 mg/L）比較接近，而R2最小（R2-7：2.13 mg/L，R2-14：2.26 mg/L，R2-35：2.43 mg/L）。結果表明，氯化銨（R1-7：20.54 mg / L，R1-14：21.44 mg / L，R1-35：22.12 mg / L）有利于出水腐殖質的形成。
核酸、尿素和游離氨基酸也是DON的重要組成部分。L-丙氨酸加料反應器中出水核酸含量較高（R3-7：7.00 mg/L，R3-15：6.10 mg/L，R3-35：8.70 mg/L）。流出尿素僅在尿素加料反應器中出現積累（R2-7：3.14 mg/L，R2-15：3.35 mg/L，R2-35：3.88 mg/L），說明尿素不易降解（< 90%）。當氨化過程受到抑制時，丙氨酸易于在厭氧流出物中殘留。然而，作者發現丙氨酸在5°C的好氧過程中很容易降解并消耗。此外，主要氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸，它們都存在于所有氮源中。總之，主要的DON是由細胞代謝產物引起，但在5℃時R2中原始底物尿素的殘留量不容忽視，占流出物DON的36%。
圖3：在第7，15和35日采樣期間每VSS（C）產生特定的DON組合，包括蛋白質、腐殖質、核酸、尿素（A）和幾種氨基酸（B）FI蛋白質類似物和FI腐殖質類似物
3、細胞膜的完整性和組成
通過BacLight染色觀察熒光顯微鏡照片和活/死細胞比顯示的細胞膜活性。在相同的采樣時間內，用尿素進料的R2，細胞膜完整率在第7天和第35天顯示最低（R2-7：50.78%，R2-35：54.74%），這說明尿素對微生物有害。相反，L-丙氨酸或D-丙氨酸作為有機氮源，提供較少的細胞膜完整率，并在第7天（R3-7：59.51%，R4-7：59.20%）、第15天（R3-15： 80.42%， R4-15：87.13%）和第35天（R3-35：59.91%， R4-35：67.61%）差異較小。然而，在實驗運行的35天期間，低細胞膜活力表明死細胞可能通過水解導致DON增加。
圖4 在5℃下具有不同氮源的SBR中細胞膜的完整性（A）和組成（B）
4、宏基因組測序分析相關基因和預測酶的變化
在R1（氯化銨）和R3（L-丙氨酸）中，包括氮代謝在內的能量代謝功能基因豐度較高。與Thaumarchaea相關的氨氧化是硝化過程中的限速步驟，在作為好氧氨氧化標志的氨單加氧酶編碼基因R1中富集amoA，有利于提高生物反應器的硝化能力。某些有助于該過程的蛋白質是nxrA（亞硝酸鹽氧化還原酶基因），一種周質底物結合蛋白，以及反硝化細菌的narG，nirS，nirK和nosZ基因。氨氧化編碼基因（EC 1.7.3.4）在低溫下均富集于R1和R3。反硝化酶的編碼基因被分配到異養群落，其比AS中的自養群落更具競爭優勢。然而，隨著硝化過程的發生，在有限的KO數據庫中未檢測到羥胺加氧酶的編碼基因。此外，許多相關基因在低溫下也能檢測，例如napA，narG，narH。考慮到R1的最高TN去除率，R1中硝化和反硝化基因的豐度似乎促進TN去除，而不是減少DON含量。然而，DON含量可能與氨化中的相關基因和氨氮同化相協調。
與尿素降解酶相關的編碼基因，如尿素酶（EC 3.5.1.5）、尿素羧化酶（EC 6.3.4.6）和嘌呤水解酶（EC 3.5.1.54），在尿素進料SBR中富集（R2）。AS中的Nitrospira可以將尿素分解成氨氮，這在5°C的所有反應器中都檢測到。此外，天冬氨酸和氨提供氨基，導致尿素循環中尿素的形成，這也解釋了出水尿素的產生。L-丙氨酸在低溫下比D-丙氨酸更具有穩定性。進料L-丙氨酸的氨化基因數高于進料D-丙氨酸的氨化基因數，說明在L-丙氨酸的利用中需要更多的微生物參與。
圖5 第35天5℃下4個SBRs中，宏基因組KEGG Orthology的氮代謝和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的相對基因分布（E值<10-5）
值得注意的是，低溫會導致天冬氨酸和谷氨酸的積累，其代謝直接位于氮代謝的上游。在第35天，只有天冬氨酸和谷氨酸都存在于四個反應器的流出物中，這可以在低溫下增加蛋白質的穩定性。微生物調節能量代謝和氨基酸代謝，包括谷氨酸，天冬氨酸和丙氨酸，以適應鹽度環境。天冬氨酸和谷氨酸積累可能是由低溫下的微生物反饋引起的。NH4 +同化（EC 1.4.1.2）是細菌的主要固定化方式。谷氨酸是氨同化作用的主要產物，是各種生物合成反應中的氮供體，可轉化為蛋白質合成的其他標準氨基酸、尿素核酸等。在死亡的AS微生物水解后，腐殖質是DON的重要來源。
5、微生物群落組成的變化
宏基因組測序結果中，細菌占99.07%，而Proteobacteria在低溫下是主要的門。而16S rRNA基因測序結果則提供了門和屬水平上的細菌多樣性信息。通過16S rRNA基因測序表明，細菌種類減少到不到一半，這表明超過一半的細菌屬不能適應5°C。從聚類分析的結果來看，SS最相似的細菌種群結構是第7天R1（氯化銨）中的樣品，這也說明氯化銨在5°C的短時間內保持了微生物的多樣性。
在第一階段（第7天），16S rRNA基因擴增子測序的結果顯示Proteobacteria在低溫下是主要的門，在R1（氯化銨）中占69.63%，在R2（尿素）中占85.28%，87.94%在R3（L-丙氨酸）中和在R4中的94.84%（D-丙氨酸）。Proteobacteria是5°C時AS中最重要和最主要的細菌門，其他優勢門是Chlorobi，Acidobacteria，Actinobacteria，Chloroflexi，Nitrospira和Bacteroidetes，它們也是常見的，低溫下在水生生態系統中檢測到的門。Pseudomonas占最高豐度（R1-38.13%，R2-37.66%，R3-61.75%和R4-66.06%），其次是Janthinobacterium（R1-11.74%，R2-35.98%，R3-20.69%和R4-24.46%）和Flavobacterium（R1-6.38%，R2-11.88%，R3-1.83%和R4-1.40%），這些常見于寒冷條件下的水生生態系統。
在第二階段（第15天），Proteobacteria和Bacteroidetes是5°C好氧反硝化中的主要門，其他細菌門占不超過1%。在屬水平上，除了R1之外，主要細菌屬沒有明顯變化。R1中的屬（> 0.01%）比其他反應器減少的更慢。然而，Pseudomonas、Janthinobacterium和Flavobacterium在所有SBRs中保持較高的豐度，就像在第7天一樣。
在第35天的第三階段，AS中的微生物群落結構與第15天基本保持穩定。在門水平上，Proteobacteria是R1（84.81%）、R2（87.60%）、R3(92.76%）和R4（92.35%）的優勢門。Bacteroidetes位居第二（R1-35：12.87%，R2-35：11.86%，R3-35：3.65%，R4-35：4.68%），Actinobacteria居第三。
在以有機氮為進料的SBR中，Proteobacteria和Actinobacteria較為豐富。在屬水平上，Pseudomonas（R1-41.37%，R2-39.85%，R3-62.33%，R4-62.33%）、Janthinobacterium （R1-29.87%，R2-36.75%，R3-27.43%，R4-24.62%）、Flavobacterium（R1-12.35%， R2-11.65%， R3-2.90%， R4-4.13%）均豐富（> 3%）。然而，在5℃下，Pseudomonas，Flavobacterium和Arthrobacter在AS中也顯示出更高的比例。
采用冗余分析（RDA）來評估第35天出水水質與細菌種群結構（> 1‰）之間的關系。RDA1和RDA2分別解釋了總方差的95.6%和3.9%。從4個SBRs的位置看，微生物群落結構明顯地根據氮源分為4組。特別是，Simplicispira（R2-0.04%）在用尿素（R2）進料的反應器中占據顯著更高的豐度，其與蛋白質呈負相關（Person test，p <0.05）。相反，Nitrospira可有效降解尿素。出水尿素（Person test，p <0.05）與DON含量呈顯著正相關。L-丙氨酸和D-丙氨酸的微生物種群存在明顯差異。更多的微生物傾向于使用D-丙氨酸，而不是L-丙氨酸，這可能導致R3的出水COD性能較低。此外，L-丙氨酸進料的Dyadobacter （R3-0.05%）豐度更高，Haliscomenobacter（R4-0.18%），Ignavibacterium（R4-0.15%），Thauera（R4-0.05%），Acinetobacter（2.87%），Nitrospira（R4-0.18%），Gp4（R4-0.04%）和Gp17（0.04%）在進料D-丙氨酸的反應器中占更高的百分比。此外，流出物中的腐殖質濃度可能與Caldilinea呈正相關（Person test，p <0.05）。值得注意的是，在氨氮上游的氨基酸和尿素的代謝與DON呈正相關（Person test，p> 0.05），而不是蛋白質，腐殖質和其他大分子有機氮。這意味著通過凝固去除DON可能是有限的。以上結果表明，氮源類型引起了明顯的微生物群落差異，從而影響了低溫下的DON組分。
圖6 冗余分析（C）和不同氮源類型SBRs 5℃下門和屬水平細菌群落
總結
本研究揭示了特定的DON組成取決于氮源，并且DON含量在5°C時是顯著的。根據成分分析，DON來自細胞代謝產物，而不是原始底物。所有氮源的出水中都存在天冬氨酸和谷氨酸。推測NH4+同化是DON形成的主要N-固定方式。RDA顯示沒有單一細菌屬可以有效降解DON，而Simplicispira在尿素進料中比例更高。作為氨基酸代謝產物的出水尿素與DON含量具有強烈的正相關性。
文章索引：
Su He, Lili Ding, Kan Li, Haidong Hu, Lin Ye, Hongqiang Ren (2018). Comparative study of activated sludge with different individual nitrogen sources at a low temperature: effluent dissolved organic nitrogen compositions, metagenomic and microbial community. Bioresource Technology 247(2018) 915-923.
原文鏈接： https://doi.org/10.1016/j.biortech.2017.09.026
