2017-02-23
以PacBio公司的SMRT單分子實時測序技術（Single molecule real-time sequencing）為代表的三代測序技術，通過其獨有的環形一致性測序模式（Circular-consensus sequence，CCS），極大提高單堿基測序的準確率，遠超Illumina等二代測序技術。與傳統轉錄組測序項目相比，利用PacBio平臺的全長轉錄組測序技術可以直接獲得mRNA的全長，保證了mRNA序列的精確性。近期我們將陸續推出全長轉錄組測序技術相關文章，供討論和交流。本期將為大家介紹全長轉錄組測序的技術原理和實驗流程。
技術原理
PacBio SMRT技術應用了邊合成邊測序的思想，并以SMRT芯片為測序載體。芯片上有很多零模波導孔（ZMW，zero-mode waveguides），每個孔底部均固定著DNA聚合酶。在文庫構建時將雙鏈模板DNA兩端加上Adapter，形成一個環狀單鏈DNA，每個環化后的DNA會落在一個零模波導孔中，與底部的DNA聚合酶結合。用4種顏色的熒光標記4 種堿基（即是dNTP）。在堿基配對階段，不同堿基的加入，會發出不同光，根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。而由于模板DNA是環狀，DNA聚合酶會一直圍繞模板DNA一圈一圈合成配對的DNA鏈。
實驗流程
將提取的總RNA進行反轉錄，合成cDNA并加接頭序列；根據片段大小將cDNA進行分割；將cDNA進行環化處理，并上機測序。詳細流程請見下圖：
下一期，我們將針對全長轉錄組測序的分析流程進行闡述，敬請期待。
